ライフサイエンス分野のためのRI実験プロトコル ～初めてRIを使う方向けの基礎実験～

放射性標識リガンド結合アッセイフォーマットには以下の3つがありますので、左記の各ページを参照し、特長に応じて選択してください。

・Filtrationアッセイ

・FlashPlateアッセイ

・SPA（Scintillation proximity assay）

アゴニストを作用させることで、GPCRが活性化し、コンフォメーションが変化することでGタンパク質複合体の結合部位が露出します。これにより、Gαタンパク質はGDPを放出してGTPに結合できるようになります。

高親和性の抗体（Kd = 10^-8～10^-11 M）を使用すると、数pg程度の抗原を検出することが可能です。基本原理は競合的結合であり、放射性標識抗原が一定数の抗体または受容体結合部位に対して非放射性抗原と競合します。

この技術の主な利点は、着目する生体分子、リガンド、または基質の生物学的特性を乱すことなく、³H、¹²⁵I、³³P、¹⁴Cのいずれかで特異的に標識できることです。

SPAビーズには以下の3つがありますので、左記の各ページを参照し、特長に応じて選択してください。

・SPAビーズテクノロジー

・FlashPlate

・Cytostar-T プレート

放射性標識化合物は細胞によって生体内の代謝前駆体と同様に代謝されます。

例えば、DNA合成を測定するために放射性標識チミジンを使用します。場合によっては、代謝できない化学物質の類似体（グルコース取り込みアッセイにおけるデオキシD-グルコースなど）を使用して、放射性化学物質が代謝されずに細胞内に留まることで取り込みプロセスをモニターすることもできます。

このアッセイでは、細胞分裂中に生成されたDNAの複製鎖へのDNAヌクレオシドである³H-または¹⁴C-チミジンの取り込みを測定します。

細胞培養はマイクロプレートで行われ、放射性標識DNAはセルハーベスターにより捕捉され、液体シンチレーションカウンタにより計測されます。また、Cytostar-Tプレートを使用することも可能です（Cytostar-Tフォーマット）。これには、ろ過やシンチレーションカクテルの添加は必要ありません。

アッセイの原理としては、まず標的細胞を⁵¹Crで標識します。その後、標的細胞はエフェクター細胞によって外敵として認識され、細胞膜破裂（溶解）を起こすことで⁵¹Crが放出されます。⁵¹Crは、サンプルを遠心分離し、上清を収集することによって分離できます。遠心分離の上清は、ガンマカウンタで直接カウントするか、マイクロプレートでシンチレーションカクテルと混合して、液体シンチレーションカウンタで検出できます。

標識方法にはいくつかの方法があり、標識されるアミノ酸や使用される反応条件が異なりますので最適な方法を選択してください。一般的に使用されるのはボルトンハンター試薬を用いた方法です。

ヨウ素の放射性同位体の半減期は比較的短く（¹²⁵Iで60日、¹³¹Iでは8日）、ヨウ素標識されたタンパク質は放射性同位体崩壊による活性の喪失および分解を受けやすくなります。したがって、ヨウ素標識タンパク質は標識後30日以内に使用する必要があります。

このアッセイにおいて、標的プロモーター配列が、動物細胞には存在しない細菌のCAT酵素をコードするDNA配列に融合されます。この酵素は、主にクロラムフェニコールのアシル化を触媒します。生成されたアセチル-クロラムフェニコール（AcCAM）を定量することにより、プロモーターの活性を測定できます。

細胞内のメチオニン含有タンパク質の³⁵S標識は、メチオニンを含まない培地を使用します。放射性標識タンパク質の定量と同定は、2次元SDS-PAGEゲルで分離し、オートラジオグラフィーまたはリン光イメージングにより測定します（他の検出方法も可能です）。

網状赤血球溶解物または小麦胚芽抽出物を使用した無細胞タンパク質翻訳にも³⁵S-メチオニンを使用することができます。

アセチル化は通常、タンパク質やペプチドのN末端、またはタンパク質内のリジン残基で起こります。また、アセチル化の実験は、³H標識酢酸ナトリウムを使用することも可能です。脱アセチル化アッセイ用の放射性基質は、放射性標識酢酸塩を使用します。

ヒストンのリジン残基のアセチル化と脱アセチル化は、エピジェネティックな調節に重要な役割を果たします。アセチル化は負電荷を与え、ヒストンの正電荷を中和し、負に帯電したDNAの結合を減らします。これによりクロマチン構造が緩み、転写に関わる分子群がDNAにアクセスできるようになります。ヒストンのアセチル化状態は、2つの酵素（ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）とヒストンデアセチラーゼ（HDAC））によってバランスが保たれています。HATおよびHDACは、ヒストンタンパク質以外のものをアセチル化および脱アセチル化することもできます。

ロースループットで実験する場合、チューブまたはバイアルで行われ、未反応の放射性標識ATPはゲル電気泳動、ろ過、密度勾配遠心分離、またはクロマトグラフィーによって基質から分離されます。ハイスループットの場合、SPAまたはFlashPlateアッセイを使用します。

細胞ベースのアッセイでは、標識されたATPではなく、32Pまたは33Pオルトリン酸または他のリン酸塩を使用します。

ある酵素の基質として標識化合物を用い、標識された部分を含む生成物を適当な方法で分取し、その放射能を検出することにより、その酵素の活性を測定します。

ジェネレータの主要部分は、多くの場合、親核種を固定したまま共存する娘核種だけを取り出すためのクロマトグラフィカラムです。このカラム に親核種を吸着させておき、溶離液を流して娘核種だけを溶出させます。カラムの充填剤としてはイオン交換樹脂、無機酸化物イオン交換体などが多く用いられます。

ここでは、ジェネレータの作製と、娘核種を用いた実験例を示します。