In vitroキナーゼアッセイ

目次

実験概要
主な準備物
製品とカタログ番号
引用文献

 


 

実験概要

基質とキナーゼを使用したin vitroキナーゼアッセイは、32P/33P/35S標識ATP(すべてγリン酸で標識)を利用して、放射性リン酸基をATPから基質へ転移させます。放射性標識されたATPと基質が分離できるのであれば、タンパク質、ペプチド、脂質などあらゆる種類の基質を使用できます。基本的には、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、またはろ過技術を使用して、放射性標識ATPを基質から分離します。

次に、リン酸化された基質の量を、オートラジオグラフィー、ホスホイメージング、または液体シンチレーションカウンタにより測定します。

 

主な準備物

32P/33P/35S標識ATP

・基質

・キナーゼ

 

測定機器

・液体シンチレーションカウンタ

・オートラジオグラフィー

・ホスホイメージャー

・フローシンチレーションアナライザー

 

製品とカタログ番号

 

キナーゼアッセイ用の放射性標識化合物

・例えばパーキンエルマー社のEasyTides製品は、ピペッティングしやすいようにバッファーに色素が添加されており、2〜8℃で保存できます。

32Pはβ線放出核種です。下の表の「γ」は、標識されているATP上のリン酸の位置を示しています。

・製品は、鉛容器で提供されるものがあります。

・比放射能が高い製品は、ATPの分子あたりの放射能が多いことを示しています。

・非標識ATPを加えることで比放射能を低下させることができます。

 

Compound Specific Activity (/mmol) Rad. conc. (/mL) Molar Concentration (μM) EasyTides Version Containing Dye in Buffer (Shipped ambient, store at 2-8°C) Frozen Version (Shipped on dry ice, store at -20°C)
ATP,[gamma-32P] 370 GBq 74 MBq 200 NEG002
111 TBq 185 MBq 1.7 NEG502H NEG002H
111 TBq 370 MBq 3.3 NEG502A NEG002A
222 TBq 370 MBq 1.7 NEG502Z NEG002Z
222 TBq 5.55 GBq 25 NEG035C
GTP,[gamma-32P] 222 TBq 370 MBq 1.7 NEG004Z

 

引用文献

Carlson, H.K. et al. Use of a semisynthetic epitope to probe histidine kinase activity and regulation. Analytical Biochemistry 397, 139-143 (2010).

Harrison, B.C. et al. Protein kinase C-related kinase targets nuclear localization signals in a subset of class IIa histone deacetylases. FEBS Lett 584, 1103-1110 (2010).

Ikebe, M., Hartshorne, D.J. & Elzinga, M. Phosphorylation of the 20,000-dalton light chain of smooth muscle myosin by the calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase. Phosphorylation sites and effects of phosphorylation. Journal of Biological Chemistry 262, 9569 -9573 (1987).

Janoueix-Lerosey, I. et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature 455, 967-970 (2008).

Olsson, H. et al. 4-Anilino-6-phenyl-quinoline inhibitors of mitogen activated protein kinase-activated protein kinase 2 (MK2). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20, 4738-4740 (2010).