In vitroキナーゼアッセイ

目次

実験概要
主な準備物
製品とカタログ番号
引用文献

 

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実験概要

基質とキナーゼを使用したin vitroキナーゼアッセイは、³²P/³³P/³⁵S標識ATP（すべてγリン酸で標識）を利用して、放射性リン酸基をATPから基質へ転移させます。放射性標識されたATPと基質が分離できるのであれば、タンパク質、ペプチド、脂質などあらゆる種類の基質を使用できます。基本的には、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー、またはろ過技術を使用して、放射性標識ATPを基質から分離します。

次に、リン酸化された基質の量を、オートラジオグラフィー、ホスホイメージング、または液体シンチレーションカウンタにより測定します。

 

主な準備物

・³²P/³³P/³⁵S標識ATP

・基質

・キナーゼ

 

測定機器

・液体シンチレーションカウンタ

・オートラジオグラフィー

・ホスホイメージャー

・フローシンチレーションアナライザー

 

製品とカタログ番号

 

キナーゼアッセイ用の放射性標識化合物

・例えばパーキンエルマー社のEasyTides製品は、ピペッティングしやすいようにバッファーに色素が添加されており、2〜8℃で保存できます。

・³²Pはβ線放出核種です。下の表の「γ」は、標識されているATP上のリン酸の位置を示しています。

・製品は、鉛容器で提供されるものがあります。

・比放射能が高い製品は、ATPの分子あたりの放射能が多いことを示しています。

・非標識ATPを加えることで比放射能を低下させることができます。

 

 

引用文献

Carlson, H.K. et al. Use of a semisynthetic epitope to probe histidine kinase activity and regulation. Analytical Biochemistry 397, 139-143 (2010).

Harrison, B.C. et al. Protein kinase C-related kinase targets nuclear localization signals in a subset of class IIa histone deacetylases. FEBS Lett 584, 1103-1110 (2010).

Ikebe, M., Hartshorne, D.J. & Elzinga, M. Phosphorylation of the 20,000-dalton light chain of smooth muscle myosin by the calcium-activated, phospholipid-dependent protein kinase. Phosphorylation sites and effects of phosphorylation. Journal of Biological Chemistry 262, 9569 -9573 (1987).

Janoueix-Lerosey, I. et al. Somatic and germline activating mutations of the ALK kinase receptor in neuroblastoma. Nature 455, 967-970 (2008).

Olsson, H. et al. 4-Anilino-6-phenyl-quinoline inhibitors of mitogen activated protein kinase-activated protein kinase 2 (MK2). Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20, 4738-4740 (2010).