FlashPlateアッセイ

目次

実験概要
アッセイフォーマット
主な準備物
製品とカタログ番号
プロトコル概要
その他のプロトコル
アッセイの最適化のために考慮する項目
その他の情報
ヒント
引用文献

 


 

概要

FlashPlate®は、シンチレータがプラスチックに埋め込まれた特殊なプレートです。FlashPlateアッセイでは、細胞膜がFlashPlateのウェルの底と側面に捕捉されます。放射性標識リガンドが結合すると、これにより放射化学物質がFlashPlateの底面および側面に近づきます。放射性標識リガンドから放出されるβ線は、ウェルのプラスチックに埋め込まれたシンチレータと相互作用し、シグナルを生成し検出可能となります。結合していない放射性標識リガンドは溶液中を浮遊しており、ウェルの壁面には接近できないためシグナルを生成しません。

FlashPlateアッセイ

 

アッセイフォーマット

FlashPlateのウェルに細胞膜を吸着させる方法は2つあります。

基本的にはFlashPlates(コーティングなし)を使用して、細胞膜をウェルに直接コーティングします。

もしくは、小麦胚芽凝集素であるWheat Germ Agglutinin(WGA)コーティングされたWGA FlashPlateを使用して細胞膜を吸着させることもできます。WGA FlashPlateは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)結合アッセイ用の96または384ウェルフォーマットで用いられます。この技術は、WGAをマイクロプレートへ共有結合で組み込んでおり、安定した結合能力を発揮します。

各FlashPlateは、ポリスチレンベースのシンチレータ、独自のタンパク質、さらにWGAでコーティングされています。WGAは受容体を捕捉するための、均一でハイスループットな受容体-リガンド結合アッセイに用いられ、GPCR以外の組換え受容体を使用して実施することもできます。

 

主な準備物

・コーティングなしのFlashPlate

・目的の受容体を発現する細胞膜

・放射性標識リガンド

・非標識リガンド(非特異的結合を測定するため)

・必要に応じたリガンドおよび試験化合物

・検出器

 

製品とカタログ番号

FlashPlateの製品詳細とカタログ番号についてはこちらをご覧ください。

 

プロトコル概要

アッセイを最適化するために、試薬の添加順序とインキュベーション時間を調整して実施します。

FlashPlateリガンド結合アッセイのワークフロー

 

その他のプロトコル

 

FlashPlate(コーティングなし)に細胞膜を直接コーティングするためのプロトコル:
使用前に、非特異的結合部位をブロックするために、0.5%BSAを含む2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、25 mM HEPESバッファー(pH 7.4)を各ウェルに加え、室温で30分間放置します。

受容体を発現する細胞を上記のHEPESバッファー(pH 7.4)で目的とする細胞膜タンパク質濃度に希釈します。希釈した細胞膜タンパク質の懸濁液(230μl)をFlashPlateマイクロプレートの各ウェルにピペットで入れ、プレートを4℃、800 x gで10分間遠心分離します。上清を除去し、プレートを4℃で一晩放置します(3時間でも実施可能)。

 

アッセイの最適化のために考慮する項目

・細胞膜または受容体の量

・結合バッファーの組成

・試薬添加の順序

・インキュベーション時間

・各プロセスの温度

 

その他の情報

・アンジオテンシンII受容体を発現する細胞膜への125I-アンジオテンシンII結合についてはこちらをご覧ください。。

 

ヒント

・実験には、可溶性受容体、目的遺伝子を高発現した細胞膜が必要です(> 100,000受容体/細胞、または > 1pmol / mgのタンパク質)。

125I標識リガンドのような高い比放射能のリガンドを使用することで、より高いシグナル/ノイズ比が得られます。

・アッセイで使用する濃度を決定するために、細胞膜/受容体の力価測定をお勧めします。

・界面活性剤、タンパク質、その他の添加物することによって、非特異的結合を減らすことができます。しかし、これらは細胞膜のプレートへの結合、またはリガンド-受容体の結合を阻害する可能性があります。

・受容体をFlashPlateに直接結合する場合は、遠心分離操作が必要です。

・FlashPlateアッセイで3H標識リガンドを使用する場合、細胞膜の量を1ウェルあたり20μg以下にすることをお勧めします。

3H標識されたリガンドは検出できるカウント数が低くなるため、アッセイが難しくなる場合があります。

 

引用文献

Brkovic, A. et al. Functional and Binding Characterizations of Urotensin II-Related Peptides in Human and Rat Urotensin II-Receptor Assay. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 306, 1200-1209 (2003).

Docagne, F. et al. A soluble transforming growth factor-beta (TGF-beta) type I receptor mimics TGF-beta responses. J. Biol. Chem 276, 46243-46250 (2001).

Rizzo, C.A. et al. Postjunctional [alpha]2C-adrenoceptor contractility in human saphenous vein. European Journal of Pharmacology 413, 263-269 (2001).