測定試料のRI計測

目次

1)代表的なRIの計測方法
__…液体シンチレーションカウンタ、ガンマカウンタ、イメージングアナライザについて

2)液体シンチレータの基礎知識
__…シンチレータの溶媒、溶質、添加物、種類について

3)液体シンチレーションカウンタ用試料の調製法の【概要】
__…状態別ごとの調製法のイメージやフローについて

4)液体シンチレーションカウンタ用試料の調製法の【詳細】
__…個体、液体、気体ごとの調製法の詳細について

5)液体シンチレーションカウンタ測定の際の注意点
__…クエンチングについて

6)計測条件の設定
__…計数効率、計測時間、その他注意点について

7)計測データの評価
__…バックグラウンドの扱いについて

※本コンテンツの出典:RI計測のためのQ&A

 

 

1)代表的なRIの計測方法

最終的に得られた試料中の放射活性を定量するには、ベータ線放出核種の場合には液体シンチレーションカウンタを、ガンマ線放出核種の場合にはガンマカウンタを使います。また、放射能分布を計測したい場合はイメージングアナライザがあります。まずは基本となるこれら機器の特長を抑えましょう。

 

液体シンチレーションカウンタによる計測法(LSC法) ~3H、14C、32P、35S等のベータ線試料の計測に適した方法~

放射線と物質との相互作用の中で励起された原子や分子が基底状態に戻る際、特定の波長の光(蛍光:Scintillation)を放出します。このような物質を蛍光物質(シンチレータ:Scintillator)といいます。このシンチレータには無機または有機物質があり、特に後者をトルエンやキシレンのような有機溶媒に溶かし、ベータ線を放出する放射性核種を含む試料と混合溶解することによって効率よくベータ線のエネルギーを蛍光に変換させ、さらに光電子増倍管(PMT)で電気信号に変換して放出されるベータ粒子の数を計測できます。この時、サンプルバイアルを2本のPMTで計測する事により、PMTから発生するノイズと目的とするサンプルからの蛍光を区別する事が可能となり、バックグラウンド値を低減できます(同時計数)。特に、LSC法は表に示すような長短所を持ち、アルファ線や低エネルギーベータ線放出核種の計測に利用されていますが、試料の化学組成によってクエンチングを生じることがあります。また、近年、LSCによるチェレンコフ効果(*)を用いた計測も行われています。

*チェレンコフ効果:透明の液体(例えば,水)の中を荷電粒子が同じ媒体中の光速度より速く運動する際、前方方向に青白い光が観測されます。この光は発光過程が物理的過程で発生するので、化学クエンチングとは無関係です。したがって,化学クエンチングを生じる水やアルコールを媒体として用いることができます。一方、色クエンチングを受けやすく、計数効率も低くなります。また、しきいエネルギー以下の電子、つまり、低エネルギーβ線の測定には向きません。

 

計測機器:液体シンチレーションカウンタ

LSCの検出器は、液体シンチレータによって生じる光エネルギーを受け取って増幅(光電子増倍管)し、感度の高い検出を行います。計測の際、計測ウインドウや印加電圧などの条件を核種に合わせて下さい。

 

計測できる核種

3H、14C、32P、35S

 

長所

①放射線の自己吸収がない。
②放射性原子の周囲はシンチレーターで囲まれており、放出された放射線のエネルギーが効率よく検出部分に吸収され、4π検出が可能である。
③試料中のβ粒子の放出率を計測することによって放射能強度が計測できる。また、蛍光強度の分布から最大エネルギーを求め、試料中の放射性核種を決定できる。

短所

①試料の化学的性質、共存物などによってクエンチング(消光)現象が生じ、検出効率が低下する。
②試料によってはケミルミネッセンスが生じることがある。

 

LSC測定時の注意

・測定しようとする核種にあったウインドウで測定すること。一般的にLSCが測定プロトコールを記憶しているので、測ろうとする核種にあったプロトコールを選択する。
・測定時間は各自の好みであるが、通常の測定では1~5分/サンプル。統計的な誤差を少なくしようとする場合は、総カウント量を揃えてもよいでしょう。ただしその場合は、放射能量の少ないサンプルは極端に測定時間が長くなってしまうので、測定時間の上限をあわせて設定するようにする。
・LSCは定期的に校正すること。校正用サンプル測定とクエンチングスタンダード測定は、数ヶ月に一度は実施すること。
・バックグラウンドは、なるべく同じ種類の非放射性サンプルを同じように処理して調製することが望ましい。ただし、臓器・組織サンプルのバックグラウンドを全ての種類で調製することは非効率的なので、Coldの血液で代用する場合が多い。
・LSCの定量限界値の設定は困難であるため、各施設の主観で決めている場合が多い。通常、バックグラウンドの2倍を超えない試料は、定量限界未満と判断する。

 

ガンマカウンタでの計測法 ~51Cr、125I等のガンマ線試料の計測に適した方法~

ガンマカウンタは液体シンチレーションカウンタ(LSC)と同様に放射線とシンチレータとの相互作用による発光(シンチレーション)を観測することにより、放射線の数や強さを計測しています。ガンマカウンターに用いているシンチレータは潮解性のある固体であるため、シンチレータを金属で覆う必要があることから、ガンマ線のみの計測となっています。また、LSCとは異なり計測サンプルにシンチレータを混ぜる必要が無いことから、ほとんどのサンプルは無調整で計測ができます。ただし、サンプルと検出器の幾何学的な位置関係により計測値が変化する事があるため、位置条件を一定とする必要があります(ジオメトリ)。

 

計測機器:ガンマカウンタ

ガンマカウンタの検出器は、RIから放出される光子が固体シンチレータにエネルギーを与えることによって生じる蛍光を光電子に変換し、増幅(光電子増倍管)することにより感度の高い検出を行います。計測の際、計測ウインドウや印加電圧などの条件を核種に合わせて下さい。

 

計測できる核種

51Cr、125I

 

イメージングアナライザでの計測法 ~放射能分布を計測する機器~

イメージングアナライザは二次元に分布している放射能からの放射線を検出します。放射線のエネルギーを特殊な物質で作られたイメージングプレート(IP)に蓄えさせ、この蓄えたエネルギーを検出します。

 

 

2)液体シンチレータの基礎知識

 

シンチレータとは

RIの放射線エネルギーにより発光(蛍光)する物質のことをいいます。

 

固体シンチレータ

無機物質:NaI,CsI,ZnS などの結晶または粉末
有機物質:アントラセン、ナフタレンなどの結晶

液体シンチレータ

    溶媒に溶質を溶解した溶液あるいはこの溶液に添加物を加えたもの

 

液体シンチレータに用いられる溶媒、溶質、添加物

 

液体シンチレータに用いられる溶媒

トルエン、キシレン、プソイドクメン、ドデシルベンゼン(LAB)、ジイソプロピルベンゼン(DIN)、1-フェニル-1-キシリルエタン(PXE)、ベンジルトルエン(ミックスアイソマー)、1,1-ジフェニルエタン(DPE)、ジオキサンなど

液体シンチレータに用いられる溶質

・第1溶質(Primary Scintillator): p-テルフェニル(TP,PTP)、2,5-ジフェニルオキサゾール(PPO,DPO)、2-(4-tert-ブチルフェニル)-5-(ビフェニル)-1,3,4-オキサジアゾール(Bu-PBD、ブチル-PBD)

・第2溶質(Secondary Scintillator): 1,4-ビス-2-(5-フェニルオキサゾリル)ベンゼン(POPOP)、1,4-ビス-2-(4-メチル-5-フェニルオキサゾリル)ベンゼン(DMPOPOP)、1,4-ビス-(O-メチルスチリル)ベンゼン(bis-MSB)

液体シンチレータに用いられる添加物(界面活性剤)

・Non-ionic detergent:トリトン X-100、エトキシライテッドアルキルフェノール、リポノックス NCI
・Anionic detergent:モノ/ジ-フォスフェイトエステル、ジ-オクチルスルホこはく酸ナトリウム

 

液体シンチレータの種類と測定例

液体シンチレータの種類

・芳香族炭化水素系シンチレータ:疎水性(脂溶性)試料に適したシンチレータで,溶媒にトルエン,キシレン,プソイドクメンなどを用いて作られます。
・ジオキサン系シンチレータ:親水性(水溶性)試料に適したシンチレータですが,現在はあまり使われていません。
・乳化シンチレータ:親水性

 トリチウム(3H)の測定例

トリチウムをLSCで測定すると,化学発光(Chemiluminescence)の影響を受けやすくなります。これは,トリチウムのβ線エネルギーが最大18 keV と小さく,化学発光のエネルギーと重なりやすいために起こります。この化学発光の影響を避けるため,試料を調製(シンチレータと混和)後,一晩静置(できれば15℃程度の低温で一晩静置)し測定することで化学発光の抑制が可能となります。

 

 

3)液体シンチレーションカウンタ用試料の調製法の【概要】

液体シンチレーションカウンタで計測する試料は、シンチレータを混合する前に試料調製が必要です。ここではその概要を示します。

 

状態別(個体、液体、気体)ごとの調整法のイメージ

計測するための試料が固体、液体、気体によって調整方法のフローが異なります。

 

計測試料の種類と調整法の対応表

計測試料の種類によって、その調整方法が異なります。

 

 

各種調整法のフロー

上記の表で試料調整法を調べたのちに、以下でその調整法の概略を把握しましょう。

サンプル調製時の注意点

・液体シンチレーションカウンタ(LSC)は、放射能量が多くなると数え落としを起こすので、バイアルにサンプルを入れる時点で、ある程度予測し、適切な値となるように調節する。
・通常、数十万dpmまでと考えておく。
・測定の結果、数百万dpmを超えて、、数え落としの可能性が考えられた場合は、調製したサンプルをいくつかに分割して測定し、後で値を合計すればよいでしょう。
・クエンチング、ケミルミネッセンスが最小限となるように配慮する。LSCの出力結果を見て、各機器特有のクエンチングパラメータやケミルミネッセンスの警告表示などを確認する。
・サンプル調製直後は安定していないため、しばらく放置してから測定するようにする。
・LSCを汚染させないように、バイアル表面にRIが付着しないようにサンプル調製を行う。LSCにかける前に、一度バイアルを拭く習慣をつけるとよいでしょう。

 

 

4)液体シンチレーションカウンタ用試料の調製法の【詳細】

 

固体試料の調整方法の詳細

1.臓器・組織
溶解法

・摘出した組織の一部分(小さな組織であれば全量)をガラスバイアルに採取し、溶解剤(ソルエン-350,ソルバブルなど)を添加します。
・最大0.2gの組織に対して、溶解剤を1~2mL程度(脂肪など溶けにくい組織は小さめに)。10%ホモジネートの場合は1mLまで添加可能(ホモジネートの方が溶けやすい)。脳、腎臓、胃等の不均一な組織中濃度を平均して測定する場合や溶けにくい組織は、ホモジネートを調製してから処理を行うとよいでしょう。骨、歯のような硬組織はアルカリ性の溶解剤では溶けません(ギ酸で脱灰する等の処理が必要)。
・50℃でときおりかき混ぜながら、数時間加温して溶解させます(大きさ、種類によっては加温しなくても溶解する)。
・30%の過酸化水素水を少しずつ添加し、カラークエンチングが起こらないように脱色します。少しずつ添加しないと泡を吹き上げてバイアルからこぼれ、大事なサンプルを失う上に周囲を汚染させるので注意します。
・添加する過酸化水素水は0.5mLまで。サンプル量が多い場合は完全な無色にはなりません。あとはLSC側の補正を行いましょう。
・シンチレータを添加します。溶解剤が通常のアルカリなのでケミルミネッセンスが発生しやすく、組織の影響でイオン濃度が高くなるので、適切なシンチレータ(ハイオニックフローなど)を選択します。
・使用シンチレータによるが、ケミルミネッセンスをなるべく抑えるために、しばらく放置してから測定します。できれば、15℃程度の低温で一晩放置するとよいでしょう。

 

燃焼法(燃焼装置が必要、3Hと14Cのみに適用可能)

・摘出した組織の一部分(小さな組織であれば全量)を燃焼用のサンプル容器に入れます。サンプルの上限は、3Hで2g,14Cで1.5gされているが、きれいに燃焼させるためには、0.5g程度に抑える方が無難です。脂肪は不完全燃焼しやすいので小さめに。下垂体、副腎などの小さな組織は早く燃えすぎてしまうので、セルロース粉末や紙などを担体として添加します。
・一晩程度放置して乾燥させると燃えやすいでしょう。燃焼補助剤(コンバストエイドなど)を1mL程度添加するのもよいでしょう。
・燃焼装置を使用して測定サンプルを調製します。3Hは3H2Oとして、14Cは14CO2として回収され、自動的にシンチレータまで入れられますが、使用前あるいは使用後には、必ず既知放射能量の標準物質を用いて、回収率を確認しておきます。

参考)溶解法と燃焼法の違い

溶解法
・特別な前処理用の機器を必要としない。
・回収率補正の必要が無い。
・着色を完全に無くすことはできない。
・骨、糞などの溶けづらいものは処理量が少なくなる。

燃焼法
・クエンチング,ケミルミネッセンス等の心配が無い。
3Hと14Cの二重標識されたものを分離して回収できる。
・溶けづらい試料も処理できる。
・特別な機器が必要。
3Hと14Cにしか適用できない。
・回収率補正が必要。

 

2.細胞・微生物

・細胞・微生物5~7mgに対して,ソルエン-350:水=8:2の溶液を1mL添加。
・50℃で2~4時間加温。
・シンチレータ(ハイオニックフロー10mL)を添加。

 

3.排泄物(糞)

・試料を均一化します。乾燥してからコーヒーミル様のもので粉砕するか、懸濁溶液(ex:0.5%CMC Na水溶液、水など)を加えてホモジナイズします。乾燥物を粉砕するときは飛散による汚染や吸引による体内被ばくに注意します。
・乾燥粉砕したものをバイアルに採取し、20mgに対して0.1mL程度の水を添加します。ホモジネートの場合は最大0.2mLまでを採取します。
・溶解剤(ソルエン-350)1mLを添加し、50℃で1~2時間加温して溶解させます。
・30%の過酸化水素水(0.5mLまで)を少しずつ添加し、カラークエンチングが起こらないように脱色させます。少しずつ添加しないと、泡を吹き上げてバイアルからこぼれ、大事なサンプルを失う上、周囲を汚染させるので注意します。
・シンチレータ(ハイオニックフロー)10mLを添加します。
・しばらく放置してから測定する。できれば15℃程度の低温で一晩放置するとよいでしょう。

※糞は溶解しづらいので、燃焼法が効果的。処理法は臓器・組織の場合と同じ。繊維質が多く、溶け残って気になる場合は、酸性の溶解剤(次亜塩素酸、硝酸など)を使うとよいでしょう。

 

4.TLCサンプル

・削り取ったシリカに水1mLを添加します。目的物質が水に溶解しない場合は、水の代わりにソルエン-350を1mL添加します(シリカからの抽出)。
・40℃で3~5時間加温します。
・シンチレータを添加します(10mL程度)。アルカリの溶解剤を使用した場合は、ケミルミネッセンスを低下させる適切なシンチレータを選択します。

 

5.ポリアクリルアミドゲル
方法1

・1~2mmのゲル片に5mLの水を添加します。
・スターラーでゲル片を軟らかくし、50℃で2時間加温します。
・水保持能の高いシンチレータ5~8mLを添加します。

方法2(多少、計数効率がよい)

・1~2mmのゲル片に0.5mLのソルエン-350を添加します。
・50℃で3時間加温します。
・ハイオニックフロー10mLを添加します。

 

6.フィルター
セルロースアセテート

・バイアルの底にフィルターを置き、水を0.1~0.2mL添加します。
・ソルエン-350を0.5~1mL添加し、室温で30分放置します。
・ハイオニックフロー10mLを添加します。

ニトロセルロース

・バイアルの底にフィルターを置きます。
・フィルターカウント(シンチレータ)5~10mLを添加します。
・フィルターが溶解するまで数時間放置します。

 

7.除タンパク時の沈殿物

・沈殿100mgに対して0.2mL程度の水を添加して懸濁します。
・組織溶解剤による溶解法または燃焼法によって測定試料を調製します。
・方法は1.臓器・組織を参照のこと。

 

液体試料の調整方法の詳細

1.有機溶媒

・サンプルに直接シンチレータカクテルを添加します。
・カクテル剤の例
ウルチマゴールドF、オプティフローO、インスタフロープラス等

2.水溶液(緩衝液)

・サンプルに直接シンチレータカクテルを添加します。
・カクテル剤の種類によっては、塩濃度が高いときの白濁や、含有できる水分量の低いものは二層に分離するなどが発生するため、適切なカクテル剤を選択します。

参考
・アルカリ、高塩濃度⇒ハイオニックフロー
・高含水率⇒ウルチマゴールドLLT、XRなど
・酸⇒ウルチマゴールドAB

3.血液

・バイアルに血液を入れ(最大0.4mL、0.05~0.1mL程度が無難)、組織溶解剤(ソルエン-350:イソプロピルアルコール=1:1混合液)1mLを添加します。
・50℃でときおり混ぜながら、15~30分加温します。
・30%の過酸化水素水を少しずつ添加し、カラークエンチングが起こらないように脱色させます。少しずつ添加しないと泡を吹き上げてバイアルからこぼれ、大事なサンプルを失う上、周囲を汚染させるので注意します。
・添加する過酸化水素水は0.5mLまで。完全な無色にはなりません。
・50℃で15分間加温し、余計な過酸化水素水を除去します。
・シンチレータを添加する。溶解剤がアルカリなのでケミルミネッセンスが発生しやすいことから、適切なシンチレータ(ハイオニックフローなど)を選択します。
・使用シンチレータによるが、ケミルミネッセンスをなるべく抑えるために、しばらく放置してから測定します。できれば15℃程度の低温で一晩放置するとよいでしょう。
3Hまたは14Cの場合はカラークエンチの無い燃焼法が効果的です。

4.血漿・血清

・最大1mLまでの血漿・血清をバイアルに入れ、水または組織溶解剤1mLを添加します。
・シンチレータを10mL程度添加します。
・透明になるまで激しく撹拌します。
・白濁あるいはゲル化する場合は、シンチレータの量を増やすか、シンチレータの種類を変える。白濁の場合は水を増量してもよいでしょう。

5.尿・胆汁

・試料に直接シンチレータカクテルを添加します。
・カクテル剤によっては尿8mLに対して12mLを添加することで、測定サンプルを調製できるものもあります(ウルチマゴールドLLT)。

気体試料の調整方法の詳細

・気体中放射能は、適切な捕集剤を用いて捕集し、シンチレータを添加して測定します。
・水蒸気であれば水、二酸化酸素であればアルカリ溶液中を通して捕集します。
・水蒸気はドライアイスなどを用いて冷却して捕集してもよいでしょう。

 

5)液体シンチレーションカウンタ測定の際の注意点

LSC法において最も注意を要する事項は、クエンチング(消光:Quenching)の防止、およびケミルミネッセンス(擬似発光)(*)の抑制です。この消光や疑似発光現象を誘発する物質をクエンチャーといいます。通常、クエンチングには、
1)ケミカルクエンチング
2)カラークエンチング
3)酸素クエンチング
4)濃度クエンチング
などの要因が考えられます。この内、ケミカルおよびカラークエンチングが発生しやすいです。ケミカルクエンチングは放射線エネルギーの溶媒への転移および溶媒から溶質への転移を妨害し、カラークエンチングは溶質から蛍光への変換を妨害します。一般的なクエンチングによって図のようなβ線スペクトルの変位を生じ、計数効率を低下させます。

*ケミルミネッセンスの抑制:化学反応に伴って生じるルミネッセンスをケミルミネッセンスといいます。酸化物やアルカリが液体シンチレーター中にわずかでも存在していたり,酸化還元反応が起こると,この現象が生じます。これによる計数は温度を下げても,また,同時計数法によっても除去されません。ケミルミネッセンスを抑制するには,酢酸,クエン酸,アスコルビン酸,鉱酸または塩酸などを加えて中和します。また,数時間放置によって減衰させるか,ケミルミネッセンスのパルスは小さいので,ゲインによってカットします。

代表的なクエンチャーを強弱ごとに分類すると次の通りです。

炭化水素、エーテル、水、
エステル、アルコール、
フッ化物、シアン化物 <  ケトン、臭化物 <  ヨウ化物、アミン類、
アルデヒド、フェノール、
ニトロ化合物

測定試料の放射能を求めるためには、標準試料と試料のそれぞれの計数率比較が最も簡便な方法です。このためには、両試料のクエンチングが全く等しいことが望まれますが、実用上は同一でない場合が多いため、何らかのクエンチング補正が必要となります。また、ルミネッセンスにも前出のケミルミネッセンスやフォトルミネッセンスがあります。前者は化学反応によって引き起こされる擬似発光で、アルカリや過酸化物の添加などによって生じます。また、後者はサンプルやバイアルに紫外線が当たることで起こる擬似発光です。

 

6)計測条件の設定

ここでは、液体シンチレーションカウンタ、ガンマカウンタで計測条件を設定する際のヒントになります。

 

計数効率とは何か?

 放射性試料を計測したとき、崩壊率(dpm)に対する計数率(cpm)の比を「計数効率」といいます。(計数効率=計数率(cpm)/ 崩壊率(dpm))

 

計数効率補正とは?

・放射能量の絶対量を求めるためには、液体シンチレーションカウンターによる計数値(cpm)を適切な計数効率で補正し、崩壊率(cpm)を求める必要があります。
内部標準法,チャンネル比法、外部標準線源法、外部標準チャンネル比法があります。
・液体シンチレーションカウンターの多くは外部標準チャンネル法による補正によって自動換算を行っています。
・標準の自動計数効率補正を行った場合、クエンチングが大きい試料については正しい値が得られないことがあります。

 

計測時間の設定は?

・計数率(cpm)が低い試料の場合、1分測定では誤差が大きく正しい値が得られないことがあります。計数値の統計的取扱は,総計数=N±N0.5ですので、たくさん数えれば数えるほど誤差は小さくなります。
・統計的に数値の持つ誤差をなるべく統一するためには、測定は総計数が同じ値になるまでの時間を行う方がよいと考えられます。ただし、計数率の低いサンプルでは測定時間が著しく長くなりますので、常識的な時間(20min.程度)を設定する必要もあります。

 

複数核種が含まれる試料を計測するときの問題点・注意点

同時に含まれる核種により、計数値に与える影響を考慮しなくてはいけません。

 

数え落としとは何か?

計数率(cpm)が高いときは、検出器の不感時間(分解時間)による数え落としを考慮しなくてはいけません。10000000 cpm を超えたら要注意。数十万 cpm 以内で計測できるよう試料調整をした方がいいでしょう。

 

 

7)計測データの評価

 

バックグラウンド(BG)とは何か?

試料からの放射線によらない計数値。原因としては、計測器によるもの、自然放射能によるもの、試料の材質によるものなどがあり、通常は30cpm 程度です。

 

BG の設定は適切か?

シンチレータに試料を入れずに複数計測し、平均した値を BG とするとよいでしょう。

 

検出限界の評価は適切か?

BG に近い計数値は、有意な値であるか否か検討が必要です。また、計測時間が異なれば計数精度も異なります。

 

 

問い合わせ先

公益社団法人日本アイソトープ協会
医薬品・試薬課
TEL:03-5395-8033
FAX:03-5395-8055 (0120-012895 注文専用)
Mail:shiyaku★jrias.or.jp
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